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Programmes de recherche financés par la Fondation ELA en 2005
Recherche fondamentale Etude du rôle de cdk2 dans le développement oligodendroglial et identification de nouveaux gènes essentiels à la prolifération et à la différenciation des progéniteurs d’oligodendrocytes Parmi les patients souffrant de leucodystrophies d'origine génétique, environ 30 % des cas restent sans étiologie déterminée malgré toutes les investigations possibles à ce jour. Le présent projet a pour objectif d'améliorer notre connaissance du rôle des gènes essentiels au développement de la lignée oligodendrogliale jusqu'au stade de l’oligodendrocyte myélinisant. L'identification de nouveaux gènes-clés du développement normal de la substance blanche est une source d'identification de nouvelles cibles moléculaires dont le dysfonctionnement potentiel pourrait être impliqué dans la physiopathologie des leucodystrophies d'origine indéterminée. L'hypo-myélinisation ou la dys- myélinisation que l'on observe dans les leucodystrophies impliquent la survenue d'erreurs à des stades spécifiques de la séquence complexe d'événements qui transforme un progéniteur oligodendrocytaire (OPCs) en une cellule oligodendrocytaire mature et capable de synthétiser la myéline. Notre attention se porte ici sur les événements les plus précoces de cette séquence, soit la prolifération des OPCs, leur sortie du cycle cellulaire et l'initiation du programme de différenciation vers l'oligodendrocyte mature : Dans cette optique, nous poursuivons deux objectifs principaux dans cette étude : 1) Nous étudions actuellement le rôle fonctionnel de la kinase cycline-dépendante de type 2 (cdk2) dans le développement de la substance blanche normale. Ce rôle de cdk2 sera ensuite analysé dans un modèle de démyélinisation acquise. Nous avons démontré dans nos travaux antérieurs que la prolifération des OPCs en culture était étroitement contrôlée par cdk2. Nous avons récemment généré une souris transgénique invalidée pour le gène cdk2 afin de déterminer le rôle de cdk2 dans la prolifération des OPCs et dans le développement global de la lignée oligodendrocytaire in vivo en conditions normale et pathologique. Au cours de l'année 2004-2005, nous avons observé que la maturation de la substance blanche des souris déficientes pour cdk2 se déroulait globalement normalement au plan de l'acquisition à l'âge adulte d'une série de marqueurs de la différenciation terminale des oligodendrocytes (CNPase, MAG, Olig2). La densité et la distribution des cellules oligodendrogliales matures chez ces souris adultes invalidées pour cdk2 est comparable à celle des homologues sauvages pour toutes les zones analysées. Par contre, nous avons observé que la densité des OPCs immatures était significativement réduite dans la substance blanche des souris adultes invalidées pour cdk2. Ceci suggère que l'activité de cdk2 est un facteur critique pour la prolifération des OPCs adultes et pas pour celle des OPCs néonataux. L'étude de cette dernière question est en cours d'analyse. Par ailleurs, de façon inattendue, nos travaux ont également démontré que cdk2 contrôle la prolifération des progéniteurs neuronaux dans l'hippocampe, dans la zone sous-ventriculaire et dans le courant de migration rostral du cerveau adulte, soit des régions qui sont la source de l'auto-renouvellement de certaines populations neuronales tout au long de la vie. Ces différentes données tendent à démontrer que l’activité de cdk2 est un facteur-clé des mécanismes de division cellulaire dans divers types de progéniteurs du cerveau adulte, tant à destin oligodendrocytaire que neuronal. 2) En parallèle, en utilisant une autre souris transgénique qui nous permet de purifier les cellules oligodendrogliales provenant de cerveau à différents stades de maturation, nous avons lancé une analyse à grande échelle (soit sur la totalité du génome de la souris) des régulations du profil d'expression génique des cellules oligodendrogliales au cours du développement de la substance blanche. Cette technique nous a permis d'identifier un gène d'intérêt ciblé, soit le facteur de transcription Sox17, dont le profil d'expression in vivo évolue sous la forme d'un pic transitoire durant les stades précoces de la différenciation des oligodendrocytes. Sur la base de ces résultats, nous avons réalisé des expériences de gain et de perte de fonction qui démontrent que Sox17 intervient dans le mécanisme de timing qui permet aux OPCs d'initier leur sortie du cycle cellulaire associée au déclenchement de leur programme de différenciation. Ainsi, des OPCs invalidés pour Sox17 restent prolifératifs plus longtemps et sont retardés dans leur capacité à se différencier. A l'inverse, des OPCs surexprimant Sox17 quittent le stade prolifératif et se différencient anticipativement Enfin, nous avons démontré que Sox17 peut interagir avec les éléments régulateurs du gène de la protéine basique de la myéline (MBP), soit un constituant structurel de la myéline. Ses différentes données font de Sox17 un nouveau gène d'intérêt dont le dysfonctionnement pourrait être à la base de troubles majeurs du développement de la substance blanche tels qu'on les rencontre dans les leucodystrophies d'origine encore indéterminée. Maladies liées à l'EIF2B : Approches physiopathologique et thérapeutique de la levure à l'homme Les maladies dégénératives héréditaires de la substance blanche du cerveau ou leucodystrophies représentent un groupe très hétérogène d’affections. Leur reconnaissance a été transformée par l’introduction des techniques d’imagerie par résonance magnétique nucléaire (IRM), faisant émerger de nouvelles formes, individualisées sur la confrontation des données cliniques et IRM. Parmi ces nouvelles entités, le syndrome CACH (Childhood Ataxia with Central Hypomyelination) ou VWM (Vanishing White Matter) a été caractérisé par un début dans la petite enfance (2-5ans) et un aspect particulier de dégradation de la substance blanche cérébrale, prenant progressivement un signal identique à celui du liquide céphalo-rachidien. Il s’agit d’une affection de transmission autosomique récessive, d’évolution sévère sans possibilité thérapeutique, aboutissant au décès 2 à 5 ans après le début des signes cliniques alors que la maladie peut être dépistée à un stade présymptomatique grâce à l’IRM cérébrale. Cinq gènes (EIF2B1 à 5) codant chacun pour une des cinq sous unités protéiques d’un facteur (eIF2B) présent dans toutes les cellules de l’organisme, impliqué dans la régulation de la synthèse protéique, particulièrement sous l’influence du stress cellulaire. Le spectre clinique des leucodystrophies liées à des mutations de ces gènes est large allant de formes à début anténatal d’évolution très sévère avec décès en quelques jours, à des formes de début à l’âge adulte d’évolution lente voir asymptomatique. Une certaine corrélation existe entre le type de mutation retrouvée et l’âge de début de la maladie. Dans les lymphocytes mutés de patients atteints de la maladie, nous avons mis en évidence une diminution de la principale activité du complexe protéique eIF2B (donneur de GTP au facteur eIF2), diminution d’autant plus importante que l’âge de début est précoce. Ce facteur EIF2B étant conservé dans toutes les espèces animales, nous avons en parallèle mis au point un modèle de levures mimant les anomalies fonctionnelles retrouvées dans les cellules humaines mutées sur lequel a été testé un lot de 2000 molécules potentiellement utilisables en thérapeutiques. Le but de ce projet est tout d’abord de poursuivre le travail sur les conséquences fonctionnelles des mutations eIF2B dans les lymphocytes de patients malades par rapport à des patients non malades par différentes approches : (a) tester l’intérêt diagnostic et pronostic de l’activité GEF d’EIF2B sur un plus grand nombre de patients, (b) identifier les variations de l’expression de tous les gènes humains connus (transcriptome), (c) étudier les effets des mutations sur les cascades métaboliques normalement déclenchées par différents types de stress cellulaire, (d) intensifier l’approche protéomique . L’approche protéomique/peptidomique consiste en l’étude des constituants peptidiques de tissus ou liquides biologiques de patients CACH/VWM comparée à celle de personnes saines, ceci afin d’identifier un ou plusieurs peptides surexprimés ou réprimés spécifiquement dans des échantillons de malades. Les études en cours sur les cellules sanguines (lymphocytes) seront étendues au liquide céphalorachidien et au cerveau (substance blanche) qui sont directement touchés et pour lesquels les chances de trouver un biomarqueur sont les plus élevées. Ces études seront également réalisées sur du sang et sur des urines, dont il est plus facile d’obtenir des échantillons. L’identification de ces " biomarqueurs " du processus pathologique aura un intérêt, non seulement dans la compréhension des mécanismes pathologiques en cause mais également pour le diagnostic et le suivi de la maladie. Nous essaierons en parallèle de comprendre pourquoi le cerveau, et plus particulièrement la substance blanche, est plus sensible aux mutations eIF2B que les autres organes. Pour cela, les composants de la voie du stress cellulaire eIF2B seront étudiés dans des cellules et extraits de cerveaux de souris à différents stades de leur développement. Des souris porteuses de mutations eIF2B (souris transgéniques) sont en cours de réalisation dans l’espoir de pouvoir disséquer les mécanismes de cette atteinte cérébrale et d’avoir un modèle murin de la maladie. La dernière approche de ce projet est de poursuivre la recherche à haut débit de molécules capables de restaurer l’activité eIF2B déficiente dans le modèle levure spécifiquement mis au point pour cela. Les molécules avec un effet potentiellement intéressant seront ensuite testées sur des lymphocytes humains mutés afin de confirmer leur intérêt thérapeutique. Les drogues d’intérêt, déjà utilisées en pathologie humaine, pourront être testées directement chez l’homme, du fait de la sévérité de la maladie en essai de phase 2 alors que les autres seront testées au préalable sur les modèles transgéniques souris en cours de développement. Rôle des protéines Slit dans le potentiel de recrutement et de remyélinisation des cellules souches neurales adultes L’existence de cellules progénitrices au sein du système nerveux central laisse entrevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de la réparation des pathologies démyélinisantes. La zone sous ventriculaire (ZSV) des ventricules latéraux est une zone germinative dans laquelle résident ces cellules. Les progéniteurs neuraux de la ZSV présentent la propriété de migrer en chaîne le long d’une voie rostrale de migration (RMS) sur de longues distances pour intégrer le bulbe olfactif. Dans le cadre de démyélinisation, ces cellules peuvent être déviées de leur voie habituelle de migration pour intégrer les régions à myéliniser et s’y différencier en oligodendrocytes. L’étude des mécanismes moléculaires permettant la migration des progéniteurs de la ZSV a permis la mise en évidence de facteurs de répulsion, les protéines Slit1 et Slit2. Nos précédents travaux de recherche ont montré que Slit1, exprimé par les progéniteurs en migration dans la RMS, est impliqué dans la direction et le mode de migration des cellules de la ZSV. Nous proposons d’étudier le rôle des protéines de guidance, Slit1 et Slit2, et de leurs récepteurs Robos dans le potentiel de recrutement des cellules issues des zones germinatives. Pour cela, nous analyserons le comportement de cellules déficientes pour ces molécules à la fois en culture mais également in vivo en induisant des démyélinisations par administration de cuprizone chez les souris invalidées pour les gènes codant pour les protéines Slits et Robos. L’identification des mécanismes moléculaires mis en jeu dans le recrutement des cellules progénitrices est primordiale et permettra à terme d’améliorer le potentiel de migration de cellules capables de se différencier en oligodendrocytes. Identification de facteurs transcriptionnels contrôlant la spécification des progéniteurs d’ oligodendrocytes L'étude du développement de l’embryon a révèlé l'importance de certaines molécules dans la production, la prolifération ou la migration des oligodendrocytes, autant de phénomènes perturbés dans les maladies dé- et dys- myélinisantes comme les leucodystrophies. Nos travaux récents réalisés sur le cerveau embryonnaire de souris, ont permis d'identifier de nouvelles molécules régulatrices du développement oligodendrocytaire. Nous avons notamment généré des lignées de souris transgéniques dont les cellules oligodendrocytaires sont fluorescentes ; on peut donc les voir et les isoler par tri laser en vue de cultures cellulaires ou d’analyses de génétique moléculaire. Nous nous proposons d’exploiter ces outils vivants afin d’identifier des gènes clefs contrôlant la production des oligodendrocytes. Nous allons donc sélectionner les cellules oligodendrocytaires au tout premier stade de leur développement et analyser leur transcriptome par la technique des micropuces à ADN. Cette étude contribuera à une meilleure compréhension du contrôle transcriptionnel de la spécification oligodendrocytaire. Elle apportera des données fondamentales, exploitables afin de promouvoir la récupération du compartiment oligodendrocytaire et la réparation de la myéline. Elle pourra également révèler de nouveaux outils de diagnostic des anomalies de l’oligodendrogénèse. Réparation de la Myéline
Promouvoir la genèse de progéniteurs d'oligodendrocytes de primate pour la réparation de la myéline du SNC La découverte depuis une dizaine d’années de l’existence de cellules souches nerveuses capables de proliférer et de générer tous les types cellulaires du système nerveux central, y compris des oligodendrocytes, a permis d’envisager le traitement des maladies affectant la myéline par thérapie cellulaire. Chez le rongeur, cette stratégie a permis de réparer la myéline dans différents modèles animaux de maladies démyélinisantes. Cependant, chez le primate, la difficulté à obtenir des cellules du lignage oligodendrocytaire in vitro a longtemps été un frein à ce type d’approches. Notre projet vise donc à optimiser l’obtention de cellules oligodendrocytaires à partir de cellules souches ou progénitrices du SNC chez le primate. Dans un premier temps, nous avons cherché à déterminer s’il existait une zone du cerveau embryonnaire plus prompte que les autres à générer des progéniteurs d’oligodendrocytes. Pour ceci, nous avons mené une étude in vitro dans laquelle différentes régions du cerveau antérieur d’embryons humains âgés de 6 à 12 semaines ont été finement disséquées et mises en culture afin de déterminer leur potentiel de différenciation. Nous avons montré que le télencephale (cortex, éminence ganglionnaire latérale et éminence ganglionnaire latérale) génère essentiellement des cellules neuronales, alors que le diencéphale (thalamus) génère un grand nombre de cellules engagées dans la voie de différenciation oligodendrocytaire. Cette dernière région du cerveau s’avère donc particulièrement intéressante si l’on envisage d’effectuer des greffes dans des modèles de maladies dysmyéliniques, puisqu’elle permet d’accroître le nombre de cellules d’intérêt. Ces résultats seront vérifiés in vivo en greffant des cellules issues des différentes régions du cerveau étudiées dans un modèle animal de maladies dysmyéliniques, la souris shiverer. En parallèle, nous avons mené une étude destinée à augmenter la proportion de cellules d’intérêt obtenues in vitro. Les cellules des différentes régions du cerveau d’embryons humains âgés de 6 à 12 semaines ont été soumises à des facteurs connus pour leur implication dans la différenciation oligodendrocytaire au cours du développement. Malheureusement, jusqu’ici, les résultats obtenus indiquent que des molécules telles que Sonic Hedgehog (Shh), Noggin et des inhibiteurs de Cystatine C connus pour leurs effets positifs sur l’oligodendrogenèse chez les rongeurs ne sont pas capables d’induire une différenciation des cellules immatures vers la voie de différenciation qui nous intéresse. D’autres molécules telles que l’IGF-1 sont actuellement à l’essai. Nous avons également analysé l’effet de la surexpression de facteurs de transcriptions Olig 1/2 sur la génèse d’oligodendrocytes. Nos résultats indiquent que la surexpression de Olig 2 double le nombre de progéniteurs d’oligodendrocytes de primate indiquant que cette stratégie basée sur le contrôle de certains gènes s’avère plus efficace que celle basée sur l’utilisation de molécules décrites préalablement chez les rongeurs. Une fois les cellules différenciées vers le lignage d’intérêt, celles-ci seront sélectionnées et greffées dans des modèles animaux de maladies dysmyéliniques. A terme, ces études menées chez le primate (humain et macaque) devraient permettre d’effectuer des greffes dans des modèles animaux proches de la pathologie humaine et d’effectuer un nouveau pas vers la thérapie cellulaire des leucodystrophies affectant la myéline chez l’homme. Etude du potentiel myélinisant de cellules issues des différents territoires télencéphaliques chez le primate humain et non humain : vers une thérapie cellulaire des maladies affectant la myéline du système nerveux central. La découverte depuis une dizaine d’années de l’existence de cellules souches nerveuses capables de proliférer et de générer tous les types cellulaires du système nerveux central a permis d’envisager l’obtention d’un grand nombre d’oligodendrocytes pour le traitement par thérapie cellulaire des maladies affectant la myéline. Chez le rongeur, cette stratégie a permis de réparer la myéline dans différents modèles animaux de maladies démyélinisantes. Cependant, chez le primate, la difficulté à obtenir des cellules du lignage oligodendrocytaire in vitro a longtemps été un frein à ce type d’approches. Ce projet vise donc à optimiser l’obtention de progéniteurs oligodendrocytaires à partir de cellules souches nerveuses chez le primate. Pour ceci, nous envisageons une approche en trois étapes : dans un premier temps, une étude histologique menée chez l’embryon humain issus d’IVG et chez l’embryon de macaque nous permettra de décrire l’émergence des progéniteurs d’oligodendrocytes au cours du développement précoce du cerveau antérieur. Dans un deuxième temps, les trois territoires télencéphaliques principaux (cortex, éminence ganglionnaire latérale et éminence ganglionnaire médiane) seront disséqués finement et mis en culture afin d’évaluer leur potentiel respectif à générer des cellules du lignage oligodendrocytaire in vitro. Enfin, les cellules issues de ces trois régions seront transplantées dans des modèles animaux de maladies dysmyéliniques afin d’évaluer leur potentiel respectif à réparer les lésions et à générer de la myéline in vivo. En parallèle de ces trois étapes, nous évaluerons l’effet de différents facteurs sur la différenciation in vitro des cellules souches et progénitrices d’embryons humains et non humains afin d’optimiser l’obtention de progéniteurs d’oligodendrocytes. Les cellules différenciées seront alors sélectionnées et greffées dans des modèles dysmyéliniques. A terme, ces études menées chez le primate devraient permettre d’effectuer des greffes dans des modèles animaux proches de la pathologie humaine et d’effectuer un nouveau pas vers la thérapie cellulaire des leucodystrophies affectant la myéline chez l’homme. Identification de gènes Identification d'un gène de leucodystrophie de cause indéterminée sur le chromosome 11q14.3 La cause demeure inconnue dans environ 30% des leucodystrophies lorsque l’ensemble des examens complémentaires ne permet pas d’identifier une anomalie spécifique d’une forme particulière de leucodystrophie. L’existence probable de causes multiples dans ces leucodystrophies de cause indéterminée rend leur étude particulièrement délicate par les techniques de génétique habituellement utilisées pour la localisation de gène(s) impliqué(s). Nous avons localisé un de ces gènes sur le chromosome 11, grâce à la découverte d’un petit remaniement chromosomique (microdélétion) chez un jeune homme (cas index) porteur à la fois d’une leucodystrophie sans cause et d'un albinisme oculo-cutané. Cette délétion recouvre une région chromosomique mesurant 1,7 Mb et contient un certain nombre de gènes candidats pour expliquer la survenue de cette leucodystrophie. Plusieurs gènes très intéressants, GRM5, CTSC et LOC143680, étaient ainsi localisés au sein de la région délétée. L’implication de ces trois gènes a été éliminée grâce à une recherche négative de mutation menée simultanément chez le cas index et dans une population de 48 malades atteints de leucodystrophies de cause indéterminée. Ce travail a été réalisé dans le cadre d’une collaboration avec l’équipe INSERM U384 (Pr Boespflüg-Tanguy). Par la suite, nous avons débuté l’analyse des gène(s) candidat(s) situé(s) en dehors de la délétion mais dont la fonction pourrait être altérée en raison d’un effet de position. A ce titre, il existait deux gènes candidats très intéressants en raison de leur fonction. Si l’implication du premier semble pouvoir être exclue, des analyses complémentaires sur le deuxième gène sont nécessaires avant de tirer des conclusions définitives. Les intérêts de cette étude comprennent l'accès à un nouvel examen diagnostique et une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires à l'origine des leucodystrophies, étape nécessaire pour la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques. Elucider le rôle de la protéine MLC1 dans la physiologie du cerveau et son implication dans la pathogénèse de la MLC, recherche d'un second gène impliqué dans la MLC1 La leucodystrophie avec mégalencéphalie kystique (MLC) est une forme rare de leucodystrophie. Les manifestations cliniques sont des troubles de la marche à début précoce suivie de signes neurologiques et d'une détérioration mentale d'évolution progressive. Ce syndrome est caractérisé par une augmentation de la taille du cerveau (megalencéphalie), reflétée par l’augmentation de taille du périmètre cranien au cours de la première année de la vie. L'imagerie par résonance magnétique (IRM) montre une atteinte sévère et précoce de la substance blanche bien que les manifestations neurologiques durant les premiers stades de la maladie soient relativement modérées. Dans les stades plus avancés de la maladie, une lente détérioration cognitive apparaît, aggravant le handicap lié à la maladie . MLC est une maladie transmise sur un mode autosomique récessif : il y une absence de signes cliniques ou IRM chez les parents qui sont tous les deux transmetteurs de la maladie, la maladie ne s’exprime que chez les enfants qui reçoivent les deux gènes anormaux de chacun de leur parents. Actuellement, 26 mutations de type divers ont été décrites dans le gène MLC1 localisé sur le chromosome 22 en 22q13.3. Une étude préliminaire de recherche de mutation sur le gène MLC1 sur une population de 18 patients appartenant à 15 familles, nous a permis d’identifier 11 nouvelles mutations. Chez certains patients, aucune mutation n’a été détectée, laissant supposer l’existence d’au moins un autre gène donnant un tableau de MLC. MLC1 code une protéine membranaire, qui est exprimée au niveau des neurones et des jonctions astrocytes-astrocytes. Basé sur des études de comparaison de structure avec des outils bioinformatiques, la protéine MLC1 semble être similaire à un canal qui transporte des ions. Dans ce projet, nous nous proposons de continuer la caractérisation des mutations MLC1 chez de nouveaux patients. La recherche d’un ou plusieurs autres gènes impliqués dans cette pathologie, se fera à partir des familles sans mutation MLC1, en particulier trois familles atteintes provenant de la même région très limitée du Sud de l’Italie et des familles consanguines d’origine turque. Le travail consiste à identifier les régions chromosomiques que les individus atteints ont reçu en commun en utilisant des marqueurs qui permettent de distinguer les individus entre eux (marqueurs polymorphes). Pour avoir plus de chance de trouver cette petite région commune, comprenant le gène qui est responsable de leur maladie, l’ADN des individus atteints sera analysé avec des milliers de marqueurs par une technique de puces à ADN. Nous voulons en parrallèle élucider la fonction de la protéine MLC1, pour faire la lumière sur la physiopathologie et nous aider à développer des stratégies thérapeutiques dans cette leucodystrophie actuellement au dessus de toute ressource thérapeutique. Recherche du gène impliqué dans une nouvelle leucodystrophie avec atteinte hépatique, surdité et cardiomyopathie Les leucodystrophies représentent un groupe très hétérogène de maladies héréditaires qui touchent la substance blanche et son principal composant, la myéline. Nous avons individualisé une nouvelle leucodystrophie qui se manifeste entre 3 et 4 ans par des troubles de la marche puis une atteinte hépatique et cardiaque. Nous avons recherché le gène impliqué dans cette nouvelle leucodystrophie de transmission autosomique récessive grâce à l’étude d’une famille consanguine sur 4 générations, comportant 54 individus dont 3 sujets atteints. Nous avons identifié une région liée à la maladie sur le chromosome 1. Actuellement, nous avons dénombré dans cette grande région 176 gènes dont 108 sont de fonction connue. Nous nous proposons de poursuivre notre effort d’identification du gène impliqué dans cette nouvelle leucodystrophie en testant des gènes candidats situés dans la région liée à la maladie, sélectionnés sur leur profil d’expression et leur fonction. En cas d’identification du gène en cause, une approche fonctionnelle nous permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie. Cette identification permettra également de tester l’implication de ce gène dans le vaste groupe des leucodystrophies de cause indéterminée avec une aspect IRM proche. Défauts moléculaires impliqués dans la maladie La maladie de Pelizaeus-Merzbacher (PMD) est une leucodystrophie d’origine génétique touchant le système nerveux central (SNC) et son principal constituant la myéline. Cette maladie est caractérisée par un trouble de la formation de cette gaine de myeline par les cellules myélinisantes du SNC, les oligodendrocytes. La maladie se traduit par un trouble du développement moteur très précoce dont la sévérité est variable. Le gène PLP1, codant pour les principales protéines structurales de la myéline du SNC, est impliqué dans la PMD. L’anomalie la plus fréquemment rencontrée est une duplication de l’ensemble du gène PLP1, responsable d’une augmentation anormale de la quantité de la protéine PLP, délétère pour le processus de myélinisation par les oligodendrocytes. Nous avons étudié une cohorte de 443 patients souffrant de la PMD et nous avons retrouvé une anomalie du gène PLP1 pour seulement un tiers d’entre eux. Notre objectif est d’identifier l’anomalie en cause chez les patients souffrant de cette maladie sans anomalie du gène PLP1 détectée, appelé PMLD (maladie PMD Like). Pour cela nous proposons trois approches : - l’étude des éléments de régulation du gène PLP1 - l’étude de gènes candidats - l’analyse de familles consanguines Ce projet nous permettra d’une part de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de la PMD en étudiant la régulation du gène PLP1 et d’autre part de rechercher d’autres gènes potentiellement impliqués dans un but de conseil génétique et de dépistage prénatal.
Physiopathologie Analyse des voies d'acheminement de la membrane de la myéline Une sous-classe des leucodystrophies héritées, comme la maladie de Pelizaeus-Merzbacher (PMD) et la Paraplégie Spastique de Type-2 (SPG2), est provoquée par la mutation du codage de gène pour la protéine principale de la myéline PLP. La pathologie moléculaire des mutations faux-sens de PLP été en grande partie étudiée dans les cellules hétérologues. Nous avons étudié le trafic et le renouvellement de la protéine PLP de type sauvage et mutante dans les cellules oligodendrocytes. Comme le transport dans la membrane de la myéline en général n'est pas bien compris, une partie de notre projet se concentre sur la caractérisation des voies d'acheminement de la myéline. Dans la deuxième partie, nous étudions les erreurs de trafic des mutations faux-sens msd et rsh de PLP, qui modèlent respectivement la forme grave de la PMD et la forme légère de SPG2. Nous avons constaté que les deux mutations modifient la morphologie des oligodendrocytes en corrélation avec la gravité de la maladie facilitée et conduisent en grande partie à une absence de PLP/DM20 à la surface des cellules. Alors que le msd PLP/DM20 était maintenu dans le RE, le rsh PLP/DM20 pouvait surmonter la rétention de le RE et résidait dans les endosomes/lysosomes tardifs. Il est intéressant de noter que la liaison de cholestérol et l'association lipidique 'raft' du mutant PLP/DM20 ont été altérées. En outre, le renouvellement du mutant PLP/DM20 a été augmenté en comparaison avec la protéine de type sauvage, démontrant ainsi que la protéine mutante se dégrade rapidement. Ainsi, ce n'est pas l'accumulation de la protéine du mutant PLP/DM20 qui nuit aux oligodendrocytes. La dégradation de PLP/DM20 mal repliée a été préférentiellement réalisée par le protéasome, mais une dégradation lysosomale du rsh PLP/DM20 peut se produire en plus. Nous en concluons que les anomalies de trafic distinctes sont associées aux mutations faux-sens de PLP. Plus important encore, l'accumulation et le dépôt de protéine mal repliée n'est pas une caractéristique pathologique des leucodystrophies PMD et SPG2. Nous avançons l'idée que l'altération du cholestérol et l'interaction lipidique 'raft' est responsable des erreurs de triage du rsh PLP/DM20 vers les lysosomes et peut ainsi expliquer la dysmyélinisation dans la SPG2. Caractérisation moléculaire dans un système modèle de la relation génétique observée entre pABC1 (un orthologue de l'ALDP) et PEX2 De nombreux aspects des maladies peroxysomales, en particulier la relation entre le gène affecté et les multiples caractéristiques de la maladie, restent encore obscurs. Afin de mieux comprendre ces phénotypes complexes, il est indispensable de travailler sur des systèmes modèles " simples ", aisément manipulables en laboratoire. Les champignons filamenteux constituent un modèle intéressant puisque, situés à la frontière des eucaryotes uni- et pluricellulaires, ils permettent d’aborder des problèmes de développement que les levures, unicellulaires, ne permettent pas d’étudier. Ainsi, chez Podospora anserina (dont la séquence du génome a été réalisée), nous avons montré qu’un mutant pex2 d’assemblage des peroxysomes (syndrome de Zellweger chez l’Homme), entraîne un défaut de différenciation. Ce défaut peut être " court-circuité " soit par l’expression du transporteur ABC peroxysomal humain PMP70 soit par celle d’un transporteur ABC peroxysomal de P. anserina (pABC1) ; une partie de la fonction des transporteurs ABC est donc conservée de l’homme à P. anserina. Une telle relation entre les transporteurs ABC (ALDP et PMP70) et PEX2 est aussi observée chez l’Homme et reste totalement inexpliquée pour le moment. Nos récents résultats suggèrent que cette relation entre les transporteurs ABC et une protéine de la membrane peroxysomale est spécifique à PEX2. Le projet que nous souhaitons développer maintenant est de mieux comprendre cette relation qui existe entre des protéines de fonctions apparemment très différentes. L’étude de cet aspect mal connu des transporteurs ABC pourra contribuer à la mise à jour de leur implication dans des fonctions inattendues. Et, dans le cas de l’adrénoleucodystrophie, il faut noter que le manque d’information sur la fonction de l’ALDP est, actuellement encore, une barrière à la compréhension de la maladie. Parallèlement à ce travail, nous étudierons d’autres voies qui permettent de " court-circuiter " une déficience peroxysomale (PEX2). La connaissance de ces voies permettra peut-être, à terme, d’envisager des nouvelles thérapies des maladies peroxysomales. Rôle de l'acide phytanique dans la pathogenèse du système nerveux en utilisant les modèles souris de la maladie de Refsum La maladie de Refsum est provoquée par l'accumulation d'un acide gras à chaîne ramifiée, appelé acide phytanique. Les patients présentant la maladie de Refsum ne peuvent pas décomposer cet acide gras provenant de l'alimentation et commencent alors à accumuler de l’acide phytanique dans leurs tissus, y compris dans le système nerveux. À un certain stade (la plupart du temps, passées les premières années de l'enfance) les niveaux élevés d'acide phytanique commencent à poser des problèmes aux patients. Les symptômes cliniques principaux sont la retinite pigmentaire, la polyneuropathie périphérique et l'ataxie cérébelleuse. On ne sait pas pour le moment, cependant, par quel mécanisme l'accumulation d'acide phytanique peut occasionner ces problèmes. Nous cherchons précisément à étudier ce mécanisme en utilisant le modèle de souris utilisé pour la maladie de Refsum. Ces souris ont été créées avec la même anomalie que les patients présentant la maladie de Refsum. Les études préliminaires ont montré que lorsque ces souris étaient nourries selon un régime contenant du phytol, celui-ci est transformé en acide phytanique par les souris et cet acide s'accumule ensuite dans leur organisme, tout comme pour les patients humains. Ce modèle de souris nous fournit une possibilité unique d'étudier les mécanismes qui déterminent le développement des symptômes cliniques. Après avoir nourri les souris avec ce régime spécial, nous réalisons plusieurs tests, par exemple l'observation de leur démarche et des tests sur le fonctionnement de leur système nerveux. Après ces tests, les souris sont sacrifiées et nous faisons alors des examens macro et microscopiques de leurs tissus. En outre, nous déterminons les niveaux d'acide phytanique dans ces tissus de sorte à pouvoir établir un lien entre les niveaux d'acide phytanique et les changements constatés sur les souris. Chondrodysplasie ponctuée rhizomélique et rôle des plasmalogènes dans sa pathogenèse incluant la formation anormale de myéline Les chondrodysplasies ponctuées rhizoméliques sont des troubles péroxisomaux dans lesquels l'anomalie biochimique principale est l'affaiblissement de la biosynthèse des plasmalogènes. Ceux-ci ont une grande importance dans toutes les membranes cellulaires, et particulièrement dans les feuilles de myéline du système nerveux central et périphérique. Le but du projet est d'apporter des réponses aux questions suivantes : Pour obtenir des informations sur le tableau clinique des patients de RCDP, deux questionnaires ont été préparés et envoyés aux médecins qui étaient en contact avec notre laboratoire à des fins de diagnostic. Les réponses reçues aux questionnaires seront corrélées avec le profil biochimique des patients dans la suite du projet. Pour caractériser encore davantage le rôle joué par le système nerveux central chez les patients souffrant de RCDP, nous avons analysé les images RM de 11 patients ayant la RCDP. Nous avons constaté que le phénotype grave de RCDP est lié à des niveaux de plasmalogène gravement diminués et s’accompagne d’anomalies régressives et développementales sur IRM. Les patients avec un phénotype de RCDP plus léger ont seulement des niveaux de plasmalogènes modérément réduits et aucune anomalie à l'IRM. Nous n'avons observé aucune corrélation entre les niveaux d’acide phytanique du plasma et les anomalies de IRM. Ces observations ont été consignées et le manuscrit a été soumis. Afin d'étudier le rapport entre les plasmalogènes et la myélinisation, nous déterminons l'expression des enzymes synthèsant les plasmalogènes dans le système nerveux, à la fois dans les tissus murins et les tissus humains. Au cours de la dernière année, nous avons rassemblé des organes de souris d’âges différents (20, 60, 180 jours) et des deux sexes. Nous avons observé que dans le cervelet de la souris l'expression des enzymes synthèsant les plasmalogènes est présente dans toutes les couches cellulaires et présente un pic à 60 jours. Nous avons également constaté que l'expression chez les souris mâles est plus élevée que chez les souris femelles. L'investigation sur ce point sera poursuivie avec l'analyse des tissus restants. Nous détecterons également les plasmalogènes in situ dans le type sauvage et le modèle de souris de RCDP (souris 'knockout' PEX7). Les études réalisées sur les murins seront réalisées également sur les tissus humains. Les alkylglycérols peuvent servir de précurseurs aux plasmalogènes lorsque la synthèse des plasmalogènes est altérée comme dans la RCDP. Ceci a été observé dans des lignées cellulaires de patients atteints de RCDP et dans le modèle de souris. Malheureusement l'huile de foie de requin, qui contient des montants relativement élevés d'alkylglycérol et que l'on peut trouver en pharmacie n'est pas adaptée aux patients souffrant de RCDP, puisqu'elle contient un peu d'acide phytanique. Actuellement, de l'alkylglycérol épuré (alcool de batyl) est en cours de traitement en vue d'une utilisation quotidienne par les patients. Le premier dosage sera donné aux patients en septembre 2005. Le rapport suivant fournira des informations complémentaires sur la sécurité et les effets de l'alcool de batyl avec des patients atteints de RCDP. Physiopathogènese des modèles murins de l’Adrénoleucodystrophie L'adrénoleucodystrophie (ALD) est une maladie génétique liée au chromosome X qui peut débuter dans l'enfance (CCALD), l'adolescence ou l'âge adulte (AMN). Elle se caractérise par une démyélinisation du système nerveux central et une insuffisance surrénalienne. Dans ses formes cérébrales (les plus graves), la maladie débute entre 5 et 12 ans et évolue rapidement vers un état grabataire, puis la mort. Le défaut biochimique est un déficit de l'oxydation peroxysomale des acides gras à très longue chaîne (AGTLC) qui s'accumulent dans la substance blanche du cerveau et d'autres tissus. Cette accumulation a probablement un rôle déstabilisant sur les membranes et donc sur la myéline, et un rôle toxique sur les surrénales. Le gène muté dans la maladie a été cloné dans notre laboratoire (Mandel/Aubourg), et code une protéine (ALDP) de transport localisée dans la membrane des peroxysomes. Nous avons montré que l'inactivation de ce gène chez la souris ne produit pas des symptômes similaires à la forme précoce (CCALD) mais plutôt adulte (AMN) de la maladie humaine. Cette souris knockout pour ALDP est désormais un bon modèle animal pour étudier les causes menant à la maladie et pour éssayer des stratégies thérapeutiques. Nous avons généré des souris transgéniques qui surexpriment la protéine ALDRP, un autre transporteur du peroxisome, et nos résultats montrent une correction du phénotype biochimique et clinique de la souris ALD. Un de nos buts est donc de trouver des substances qui permettent d’augmenter la quantité d’ALDRP. Actuellement, nous avons montré qu’un antiépileptique connu est capable d’agir sur la production d’ALDRP. Cette molécule ou d’autres ayant des propriétés équivalentes pourront être utilisées lors d’un futur essai clinique chez l’homme. Deuxièmement, l'utilisation d’un modèle souris que nous avions généré, où ALDRP et ALDP sont absents, a l’avantage de développer la maladie plus précocement et avec une atteinte plus sévère que la souris knockout pour ALDP seulement. Une étude de ces souris avec la technologie " puce d’ADN " nous a permis de montrer que la mitochondrie, sorte de centrale énergétique pour la cellule, était endommagée. Ce défaut pourrait être impliqué dans le développement de la maladie et mérite une étude plus approfondie. Troisièmement, de récentes études faites par le groupe de Patrick Aubourg, ont montré qu’un autre transporteur du peroxisome (PMP69) qui appartient à la même famille que ALDP et ALDRP est impliqué dans la sévérité de la maladie. Pour cette raison, nous voulons produire une souris qui ne contiendrait ni ALDP ni PMP69 afin d’étudier le rapport fonctionnel entre les deux transporteurs et la fonction en soi de PMP69. Analyse des mécanismes dégénératifs induits par les acides gras à très longue chaîne (AGTLC) dans les neurones et les cellules gliales. L'X-ALD est une maladie héréditaire grave affectant principalement les garçons. L'accumulation des acides gras ayant 22 atomes de carbone ou plus est caractéristique de cette maladie. Une défaillance de la cascade d'enzymes responsable de la dégradation de ces acides gras s'avère responsable de cette accumulation dans le corps des patients. Au cours du projet, nous souhaitons étudier si les acides gras avec C ≥ 22 sont toxiques pour les cellules du cerveau. Comme les cellules du cerveau humain vivantes ne sont pas favorables à de telles expériences, nous employons des cellules du cerveau de rat de culture, qui peuvent être isolées. Les cellules sont maintenues vivantes sur des plaques en verre accessibles à l'examen microscopique. L'emploi de colorants fluorescents sensibles aux ions permet de suivre les réactions des cellules de cerveau de rat à l'application des acides gras. En outre, nous pouvons voir comment la réaction à d'autres substances change en présence des acides gras. Enfin, les méthodes employées montrent si les cellules du cerveau peuvent survivre en présence de ces acides gras et sur combien de temps. Les résultats attendus montreront si les acides gras s'accumulant dans la X-ALD entraînent la mort des cellules du cerveau et la disparition de la gaine de myéline. Cette dernière est la raison des effets néfastes de la maladie. Un abaissement des acides gras dans le sang ("Huile de Lorenzo") n'a pas empêché les dommages causés au cerveau. Si un effet néfaste des acides gras (C ≥ 22) sur des cellules spécifiques du cerveau pouvait être démontré, de nouvelles études cliniques pourraient alors être poursuivies. Fonction et régulation du gène ABCD2 (ALDR) L’adrénoleucodystrophie liée à l’X (X-ALD) est la maladie génétique peroxysomale la plus fréquente. L’X-ALD est caractérisée sur le plan biochimique par une accumulation d’acides gras à très longue chaîne qui pourrait être la cause de la dégénérescence cérébrale progressive et des atteintes surrénaliennes souvent observées chez les patients. L’X-ALD est associée à des mutations dans le gène ABCD1 (ALD) qui code pour une protéine supposée transporter les AGTLC afin de permettre leur dégradation dans le peroxysome. Un gène très homologue (ABCD2, ALDR) est partiellement redondant puisque sa surexpression dans des fibroblastes de patients X-ALD ou dans le modèle animal de la maladie (souris X-ALD) peut suppléer à la déficience de la protéine ALDP. Le but final de nos recherches est de tenter d'augmenter la production cellulaire de la protéine ALDRP dans le cerveau ou les surrénales par un traitement pharmacologique. Notre projet consiste à caractériser les voies de régulation de l'expression du gène ALDR. Cette approche devrait fournir des indications pour nous guider dans un choix ciblé de molécules actives. Ces molécules seront testées in vitro dans des cultures de cellules et in vivo chez le rat ou la souris. En parallèle, nous avons entrepris de caractériser la fonction de la protéine ALDRP dans son contexte peroxysomal et d’analyser ses interactions avec d’autres protéines. Ce travail devrait apporter des informations essentielles à la compréhension du transport des acides gras à travers la membrane peroxysomale et par extension, de mieux appréhender le phénomène de redondance fonctionnelle (principe de base d’une éventuelle thérapie pharmacologique de gène) entre ALDRP et ALDP. Identification de nouveaux exons dans le gène PLP1 humain : caractérisation et étude fonctionnelle de nouveaux transcrits, étude de leur implication en pathologie humaine. Les protéines majeures de la myéline du système nerveux central (SNC), PLP et DM20, sont codées par un même gène : le gène des protéolipoprotéines ou PLP1. Ces protéines jouent un rôle majeur dans la stabilisation et la compaction de la gaine de myéline autour de l’axone, permettant une transmission rapide de l’influx nerveux. Chez la souris, l’existence d’un nouvel exon du gène PLP1 a été démontrée et a pour conséquence l’expression de deux protéines supplémentaires : sr-PLP et sr-DM20. Leur rôle n’est pas encore clairement établi mais il semble être différent de celui des protéines " classiques ". Bien que le gène PLP1 et les deux protéines PLP et DM20 soient très conservés à travers les espèces, le nouvel exon identifié chez la souris n’est pas conservé chez l’homme. Nous nous sommes intéressés à analyser la séquence de l’intron 1 du gène PLP1 humain afin d’identifier comme chez la souris l’existence d’exon(s) supplémentaire(s). Par analyse bioinformatique, 4 séquences pouvant potentiellement correspondre à des exons ont été identifiées. Parmi celles-ci, 3 ont été confirmées expérimentalement à partir de prélèvements de cerveaux humains. Ces nouveaux exons du gène PLP1 conduisent à l’expression de nouveaux ARNm PLP1 à la fois chez l’adulte et le foetus. Notre projet vise : En conclusion, ce travail permettra de mieux connaître les fonctions physiologiques du gène PLP1 et de mieux appréhender comment il intervient dans les mécanismes pathologiques. Leucomalacie périventriculaire et anomalies cérébrales chez les enfants prématurés : application de la tractographie pour décrire les mécanismes La mortalité chez les prématurés a énormément diminué ces dernières années, ce qui a pour conséquence une augmentation de la survie de nouveau-nés de très petit poids. Ces nouveau-nés présentent un fort risque de lésions cérébrales entraînant des séquelles importantes sur le plan moteur et cognitif. Les lésions cérébrales, appelées leucomalacies périventriculaires, siègent principalement dans la substance blanche périventriculaire. Une meilleure compréhension de la physiopathologie de ces lésions est cruciale pour améliorer la prise en charge précoce de ces enfants et tenter d’éviter l’apparition de ces lésions. Les nouveau-nés de très petit poids présentent fréquemment des lésions plus diffuses de la substance blanche. L’hypothèse actuelle est que les lésions diffuses précoces de la substance blanche ont des répercussions sur le développement et la croissance des autres régions cérébrales (cervelet, faisceaux cortico-spinaux, radiations optiques…), puisque la substance blanche est le siège des connections entre les différentes régions cérébrales. Certaines manifestations, telles que troubles de la motricité fine, troubles de la coordination…, présentées par les anciens prématurés sont attribuables au cervelet. Mon équipe s’est intéressée aux lésions cérebelleuses des prématurés. Elle a ainsi montré une diminution de la croissance d’un hémisphère cérébelleux du côté opposé à une lésion de la substance blanche périventriculaire unilatérale. Pour continuer à étudier les conséquences des leucomalacies périventriculaires sur le développement du cervelet, j’analyserai les données des IRM (Imagerie par Résonnance Magnétique) quantitatives d’anciens prématurés présentant des lésions de la substance blanche périventriculaire isolées (sans lésion cérébelleuse). De nouvelles techniques d’exploitation des données des IRM cérébrales seront utilisées ; elles permettent de mesurer les volumes des différents compartiments du système nerveux central (la substance blanche, la substance grise, le liquide céphalo-rachidien) et de représenter visuellement les faisceaux des fibres de myéline (IRM tridimensionnelle et tractographie). Les résultats des analyses morphologiques seront ensuite corrélés au développement neurologique et intellectuel de ces enfants. Nous faisons l’hypothèse que les lésions isolées de la substance blanche vont retentir sur la connectivité cérébro-cérébelleuse et sur l’organisation et la microstructure du cervelet. Nous étudierons également si l’atteinte de la connectivité entre cerveau et cervelet entraîne des troubles spécifiques du développement neurologique et intellectuel. Cette étude fournira des informations directes sur l’établissement et l’organisation des connections cérébrales à travers l’exemple des liens cerveau-cervelet, substance blanche périventriculaire - hémisphères cérébelleux. Elle fournira des informations sur le développement, la mise en place, la structure et l’organisation topographique de la myéline. Cette étude sera également l’occasion de continuer à développer les techniques d’analyse des données accessibles grâce à l’IRM précoce de cerveaux en développement. Ces techniques seront applicables aux autres pathologies de la substance blanche, et notamment à l’étude des leucodystrophies. Etude des mécanismes physiopathologiques en cause dans une maladie génétique de l'astrocyte, la maladie d'Alexander La maladie d’Alexander (AXD) est une maladie de la myéline du système nerveux central. Elle est due à des mutations du gène codant pour la GFAP (protéine gliale fibrillaire acide), protéine qui forme, avec d’autres protéines, des filaments constituant la charpente de l’astrocyte. L’astrocyte est une cellule gliale non myélinisante, donc très différente de l’oligodendrocyte qui synthétise la myéline du système nerveux central, sa forme étoilée et ses grands prolongements lui permettent d’avoir des interactions avec toutes les autres cellules du système nerveux central. Cependant l’astrocyte joue un rôle très important aussi bien dans le fonctionnement des neurones que dans celui des oligodendrocytes; c’est pourquoi une atteinte de l’astrocyte par une mutation d’une protéine importante pour sa structure, aura des conséquences néfastes sur le fonctionnement de toutes les cellules du système nerveux central. Nous avons établi un modèle cellulaire de l’AXD dans lequel la formation d’agrégats de GFAP mutée reproduit les lésions astrocytaires observées dans cette maladie. Les premiers travaux réalisés plaident en faveur d’une toxicité de ces agrégats conduisant à une mort cellulaire ; cependant dans notre modèle, ces agrégats peuvent parfois disparaître permettant la survie de la cellule. Nous sommes en train d’étudier les mécanismes cellulaires qui permettraient de prévenir la formation ou de dissoudre les agrégats de GFAP mutée. Les voies de dégradation des protéines mal repliées seront étudiées (protéasome et lysosome), et nous mettrons en œuvre la méthode du silencing des ARN messagers (ciblant la GFAP mutée ou non) par les petits ARN interférents (RNAi). Ces travaux seront approfondis chez 2 souris knock-in exprimant des mutations de la GFAP, en cours de génération à l’Institut de la Clinique de la Souris (Pr. Chambon). Identification et caractérisation de biomarqueurs spécifiques de la leucodystrophie métachromatique et de l’adrénoleucodystrophie par des études peptidomiques comparatives Dans le cerveau, deux structures distinctes ont été décrites: la substance grise qui contient les générateurs de l’électricité cérébrale, c'est-à-dire le corps cellulaire des neurones, et la substance blanche qui contient le système de câblage complexe permettant d’acheminer l’influx nerveux. Afin d’accélérer la vitesse de l’influx nerveux, certains câbles s’entourent d’une gaine isolante riche en graisse, la myéline. La myéline joue le rôle de gaine isolante de la fibre nerveuse et permet le transport des messages nerveux. Les maladies héréditaires dégénératives touchant la substance blanche du cerveau ou leucodystrophies représentent un groupe très hétérogène d’affections. Dans les leucodystrophies, la myéline peut soit (1) se former difficilement, (2) se former correctement et par la suite s’altérer, soit (3) présenter un hyper développement. Ce sont des maladies dites " orphelines " car elles sont rares, mal connues du grand public et peu appréhendées par la recherche médicale. Il existe de nombreuses formes de leucodystrophies dont les plus fréquentes sont l’adrénoleucodystrophie (ALD) et la leucodystrophie métachromatique (MLD). Dans les deux formes, les symptômes cliniques sont très variables et aucun marqueur biologique spécifique n’est disponible à ce jour pour faciliter le diagnostic par des analyses de laboratoire et suivre l’évolution de la maladie en cours de traitement. Ceci est d’autant plus crucial que de nouvelles approches thérapeutiques telles que la thérapie génique se développent et vont nécessiter un suivi médical rigoureux. De la même façon qu’il est possible d’établir une empreinte génétique d’un patient, une empreinte moléculaire des produits de ces gènes qui sont des protéines ou des polypeptides (molécules formées à partir d’acides aminés) peut être établie grâce aux technologies modernes. En référence à la " génomique ", science qui étudie l’ADN des gènes, la science visant à étudier le profil en protéines ou en polypeptides d’un échantillon biologique est la " protéomique " ou " peptidomique ". Les peptides sont de petites protéines qui sont présents en abondance dans le cerveau où ils jouent un rôle essentiel. L’approche " peptidomique ", qui consiste à établir une empreinte digitale ou cartographie des peptides, n’a encore jamais été décrite pour ce type de leucodystophies et se révèle très prometteuse. Elle consiste en l’étude des peptides extraits de tissus ou liquides biologiques de patients comparée à celle de personne saines, ceci afin d’identifier des différences : certains peptides peuvent être surexprimés (présents en large excès) ou réprimés (présents en faibles quantités ou absents) spécifiquement dans des échantillons de malades. Ces tissus et fluides incluront en premier lieu le cerveau (substance blanche) et le liquide céphalorachidien qui sont les plus directement touchés et pour lesquels les chances de trouver un biomarqueur sont les plus élevées. Les études s’étendront par la suite au sang et aux urines, dont il est plus facile d’obtenir des échantillons. L’ensemble des données fournies permettra certainement d’identifier des marqueurs moléculaires pour le développement de tests de diagnostiques rapides, non invasifs, non douloureux et fiables. Par ailleurs, il permettra de mieux comprendre dans son ensemble les mécanismes et voies métaboliques impliquées dans la pathologie. Cette approche bénéficiera directement de toutes les compétences et de l’expertise acquise depuis de nombreuses années par les équipes impliquées dans ce projet. Approche thérapeutique Suivi en RMN de souris PLP mutées: application à l’évaluation thérapeutique de substances neuroréparatrices Les leucodystrophies représentent un groupe hétérogène d’affections génétiques caractérisées par une atteinte préférentielle de la substance blanche du système nerveux et de son principal constituant la myéline. Parmi les troubles constitutionnel de la myéline, les formes les mieux identifiées sont celles liées à des mutations du gène des protéolipoproteines (PLP). Elles peuvent être responsables, chez l’homme comme chez les nombreux mutants animaux, d’affections de sévérité très variable : les formes les plus sévères sont liées à une absence (ou paucité) de myéline (maladie de Pelizaeus Merzbacher, souris jimpy, rat md), et les formes les plus modérées à un trouble fonctionnel de l’interaction myéline-axone (paraplégie spastique liée à l’X, souris par inactivation de PLP). Dans ces affections, le challenge thérapeutique doit être non seulement la réparation de la myéline mais surtout la lutte contre la dégénérescence axonale (neuroprotection ou neuroréparation). Afin d’identifier des substances présentant un intérêt thérapeutique chez l’Homme, il est impératif de tester un maximum de nouvelles molécules sur le système nerveux central (SNC) de petits animaux sains et mutants. La souris est l’espèce offrant le plus grand nombre de souches atteintes de pathologies équivalentes à celles observées chez l’homme; il est donc impératif de maîtriser des outils permettant un suivi non invasif et non destructif de l'état de souffrance neuronale du système nerveux central (SNC) chez ces animaux. L’identification in vivo de marqueurs quantitatifs et qualitatifs de le dégénérescence axonale chez la souris est un axe majeur de recherche afin de pouvoir évaluer l’efficacité de protocoles thérapeutiques expérimentaux. Dans ce but, nous avons mis au point des méthodes d'analyse par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) de cerveaux de souris. Son utilisation dès le 5ème jour de vie postnatale nous a permis un suivi au cours du développement par Imagerie (IRM) et Spectroscopie (SRM) RMN. L’IRM a permis de visualiser des changements des interactions de l’eau avec les macromolécules de la substance blanche au cours de la myélinisation. La SRM nous permet de quantifier in vivo dans différentes régions du cerveau de souris des métabolites permettant d’apprécier la dégénérescence axonale (N-acetylaspartate (NAA)), la présence de myéline (Choline), le pool Glutamate-Glutamine. Dans ce projet, nous nous proposons de développer de nouvelles stratégies en IRM et SRM pour observer des souris soit avec inactivation du gène PLP (PLP -/-) correspondant à un modèle parfait de dégénerescence axonale progressive par trouble de l’interaction myeline-axone, soit surexprimant le gène PLP (OE-PLP) conduisant à une hypomyélinisation sévère. En collaboration avec la société NEURONAX, les méthodes RMN développées seront appliquées au suivi de souris PLP -/- traitées à l’aide d’une molécule ayant des propriétés neuroprotectrices et/ou neuroréparatrices. Les données RMN seront confrontées aux données cliniques et anatomopathologiques afin d’évaluer l’effet thérapeutique in vivo de cette molécule injectée par voie intrathécale. Correction des déficiences de la myéline dues au PLP : approche de thérapie cellulaire pour restaurer un phénotype normal La maladie de Pelizaeus-Merzbacher (PMD) est liée à des mutations du gène des protéolipides de la myéline (PLP). Les protéolipdes (PLP/DM20) constituent ~50% des protéines totales de la myéline. Dans le cerveau, la myéline est synthétisée par des cellules gliales, les oligodendrocytes, pour former une gaine isolante autour de l’axone des neurones et permettre ainsi une conduction rapide de l’influx nerveux. Dans la majorité des cas, la PMD est provoquée par l’acquisition de copies supplémentaires du gène PLP (duplication) et dans une plus faible proportion des cas, on retrouve des anomalies de la séquence du gène responsable de la production d’une protéine anormale (mutation). A l’heure actuelle, il n’existe pas de thérapies appropriées de cette maladie. Des souris transgéniques modèles du PMD exprimant des copies supplémentaires du gène PLP et une mutation spontanée, jimpy, chez la souris seront utilisées dans nos travaux. Les mutations chez la souris provoquent des troubles neurologiques et des anomalies du système nerveux similaires à ceux qui sont observés chez l’homme. Dans ce projet, nous proposons un programme de thérapie visant à la fois à réduire la surexpression du PLP normale et à corriger l’expression du PLP muté jimpy par la technique des siRNA. Des résultats préliminaires et encourageants, dans nos laboratoires, montrent une réduction efficace de la surexpression du PLP et un acheminement vers un phénotype normal des oligodendrocytes atteints en culture. Des marqueurs biochimiques et physiologiques seront testés pour vérifier la correction des anomalies en montrant que des oligodendrocytes défectueux peuvent désormais produire une membrane myélinique normale. Une deuxième étape sera consacrée à la construction de vecteurs viraux et non viraux pour tenter une expression permanente des siRNA dans les oligodendrocytes. Ces vecteurs seront utilisés pour corriger les anomalies in vivo chez la souris. Ensuite, des fibroblastes et des cellules de Schwann humaines PLP mutées seront utilisées pour mettre au point ces tentatives de thérapie avant d’entreprendre d’appliquer cette stratégie de thérapie génétique chez les patients atteints de PMD. Thérapie génique de l'AMN et de l'ALD cérébrale par cellules souches hématopoïétiques corrigées ex vivo par vecteur lentiviral Nous avons obtenu suffisamment de résultats pré-cliniques pour soumettre à l’AFSSAPS une demande d’autorisation pour un essai clinique de thérapie génique visant à évaluer la tolérance et l’efficacité de l’auto-greffe de cellules CD34+ génétiquement corrigées ex vivo avec un vecteur lentiviral à 5 patients atteints de forme cérébrale d’ALD, candidats à la greffe allogénique de moelle osseuse, mais sans donneur. Nous sommes dans l’attente d’une réponse officielle de l’AFSSAPS pour avoir l’autorisation de débuter notre essai. 1/ Il n’existe pas de traitement efficace pour les patients atteints d’adrénomyéloneuropathie (AMN) et la greffe de moelle osseuse ne leur est pas proposée, en raison des risques élevés de mortalité. Nous avons récemment démontré que la greffe de cellules normales de moelle osseuse chez la souris ALD en corrige le phénotype tardif qui ressemble à l’adrénomyéloneuropathie. Le projet de 2 ans que nous avons soumis l’année dernière vise à: - étudier les effets de la greffe de cellules normales de moelle osseuse et de cellules de moelle osseuse génétiquement corrigées à des souris doublement déficiente pour les gènes ALD et ALDR. Cette souris présente des symptômes d’adrénomyéloneuropathie plus précoces et plus sévères que la souris ALD. Ce travail sera fait en collaboration avec le Dr. Aurora Pujol (Barcelone). - déterminer quel pourcentage de chimérisme (moelle osseuse et cerveau) il est nécessaire d’avoir pour corriger le phénotype de la souris ALD ALD/ALDR. Ces résultats ont des conséquences importantes pour la greffe de moelle osseuse comme pour la thérapie génique chez les patients ALD. La mise en œuvre de ce projet a été retardée pour des raisons de conditions sanitaires de notre animalerie (détaillé en anglais dans la proposition). Nous avons cependant effectué tout un ensemble d’expériences visant à déterminer quelle sous population de cellules de moelle osseuse, il est nécessaire de purifier pour réaliser ces expériences. Celles-ci vont débuter effectivement en mai 2005. 2/ L’obtention de l’autorisation de mise en œuvre de notre essai de thérapie génique dans l’ALD est sous-tendue par la nécessité que nous fassions des expériences complémentaires chez la souris ALD visant à évaluer le risque de leucémie. En effet nous utiliserons un vecteur lentiviral qui peut s’intégrer n’importe où dans l’ADN des chromosomes et " activer " un gène dont l’activité pourrait conduire à une leucémie. Ce risque est à priori beaucoup moins élevé que dans l’essai de thérapie génique des enfants " bulle " mais il ne peut être formellement exclu. Nous avons déjà réalisé des expériences chez 2 souris qui sont rassurantes. Ces expériences, longues et coûteuses, consistent à réaliser des greffes chez des souris ALD en utilisant des cellules de moelle osseuse isolées à partir de souris ALD elles-mêmes greffées au préalable avec des cellules génétiquement corrigées avec le vecteur viral utilisé pour l’essai. Ce paradigme expérimental permet de " maximiser " les chances d’observer une leucémie. Ces expériences rentrent dans le cadre de toute une série d’expériences et d’études toxicologiques que nous avons dû réaliser pour obtenir l’autorisation pour notre essai de thérapie génique. Thérapie génique par AAV de la MLD : étapes précliniques vers l'application clinique Nous développons dans la leucodystrophie métachromatique (LDM) une stratégie thérapeutique de thérapie génique basée sur le transfert intracérébral du gène normal directement dans le cerveau. Cette stratégie est complémentaire de celle développée par L. Naldini à Milan et qui vise à proposer une autotransplantation de cellules de moelle osseuse génétiquement corrigées ex vivo avec un vecteur lentiviral. Une stratégie identique est proposée et va être bientôt mise en oeuvre dans l’adrénoleucodystrophie. Dans la LDM, le transfert intracérébral du gène normal devrait permettre cependant d’obtenir chez les patients traités un effet thérapeutique plus rapide que l’auto-transplantation de cellules de moelle osseuse génétiquement corrigées ex vivo. On sait, en effet, que la greffe de moelle osseuse nécessite au moins 12-18 mois avant qu’un effet thérapeutique soit observé, que ce soit dans la LDM, l’ALD ou les autres maladies du cerveau où la greffe de moelle osseuse est efficace. Cet élément est donc à prendre en considération compte tenu de la rapidité et la gravité de l’évolution de la maladie chez les enfants atteints de forme infantile et juvénile de LDM (début entre 1 et 5 ans). Nous avons démontré la faisabilité et l’efficacité d’une approche de transfert de gène thérapeutique (le gène codant pour l’arylsulfatase A, ARSA, qui est déficiente chez les patients atteints de LDM) dans un modèle de souris LDM. Dans la perspective de déposer à l’AFSSAPS une demande d’autorisation d’essai clinique en 2007, le projet actuel vise : 2/ à développer une nouvelle stratégie pour corriger l’atteinte du nerf périphérique chez les patients LDM. Cette stratégie repose sur le transfert du gène ASA dans le muscle qui devrait permettre d’obtenir sur le long terme une expression de l’enzyme dans les nerfs périphériques et même les cellules de la moelle épinière. |
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